张良滔
,
张立坚
,
张俊杰
,
刘春安
,
蔡春
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.00342
建立了亲水作用色谱(HILIC)测定组织中全基因组DNA甲基化水平的方法.采用苯酚-氯仿提取组织中的DNA,提取的DNA用88%甲酸在140℃下裂解,经N2吹干后,加乙腈-水(9:1,v/v)溶解,用Waters BEH HILIC柱进行分离,在277 nn波长下检测胞嘧啶(Cyt)及5-甲基胞嘧啶(5-mCyt)含量.结果表明,以乙腈-10 mmol/L甲酸铵溶液(94:6,v/v)为流动相,流速为0.5 mL/min,Cyt与5-mCyt分离较好,保留时间分别为2.6与3.1min.胞嘧啶的线性范围为1～900 μmol/L,相关系数为0.999 9;5-甲基胞嘧啶的线性范围为1～64 μmol/L,相关系数为0.999 8.胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的检出限为54 nmol/L(柱中为0.54 pmol),定量限为250 nmol/L(柱中为2.5 pmol);在5～900 μmol/L的添加水平下,胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的平均加标回收率为94.7%～100.5%,相对标准偏差小于1.48%.用该方法检测了结肠癌组织中DNA甲基化水平,结果显示该癌组织中全基因组的DNA甲基化均值为4.0%.该方法快速、简单,稳定性好,灵敏度较高,能满足全基因组DNA甲基化的检测要求.
关键词:
亲水作用色谱
,
全基因组DNA甲基化
,
组织
,
结肠癌
陈丽宇
,
张立坚
,
张良滔
,
蔡春
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2011.12015
5-羟甲基胞嘧啶通过阻止脱氧核糖核酸(DNA)甲基化转移酶l(DMNT1)甲基化胞嘧啶来影响DNA甲基化的程度.本文建立了液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定组织中全基因组5-羟甲基胞嘧啶水平的方法.采用苯酚-氯仿提取组织DNA.提取的DNA用88％甲酸在140℃下裂解,DNA裂解液加入同位素胞嘧啶作内标,经N2吹干后,加乙腈(9:1.v/v)溶解,用LC-MS/MS检测5-羟甲基胞嘧啶的含量,并计算全基因组中5-羟甲基胞嘧啶的水乎.结果表明,5-羟甲基胞嘧啶的线性范围为0.1～30 ng/mL,相关系数为0.996 9,检出限(信噪比为3计)和定量限(信噪比为10计)分别为0.057 ng/mL和0.090 ng/mL;日内相对标准偏差和日间相对标准偏差分别为5.13％和6.24％；加标回收率为90.24％～97.53％.用该方法检测了大鼠大脑组织DNA羟甲基化水平,平均结果为0.66％.该方法简便,重现性好,灵敏度较高,能满足全基因组5-羟甲基胞嘧啶定量检测的要求.
关键词:
液相色谱-串联质谱
,
5-羟甲基胞嘧啶
,
脱氧核糖核酸羟甲基化
,
组织
