姚丛
,
柯从玉
,
白泉
,
卫引茂
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2004.04.027
提出了一种从猪心中快速制备高纯度细胞色素C的方法.使用一种装有大颗粒疏水填料的简易型疏水色谱柱在实验室规模对细胞色素C进行了纯化,通过反相色谱、紫外光谱及铁含量对样品的纯度进行了检验.与经典方法相比,此方法纯化工艺简单、操作时间短,细胞色素C的质量回收率高,纯度好.
关键词:
疏水色谱
,
细胞色素C
,
纯化
,
柱技术
吴丹
,
高栋
,
白泉
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.02.014
用聚乙二醇200疏水相互作用色谱固定相(PEG200-STHIC)分别在色谱柱和色谱饼上完成了一步复性并同时纯化来源于大肠杆菌(E.coli)表达的重组人干扰素-γ,(rhIFN-γ).为了能使色谱分离方法用于不同来源的rhlFN-γ的纯化,对rhIFN-γ在反相色谱、离子交换色谱、固定化镍离子亲和色谱上的保留行为也进行了研究.色谱柱纯化的rhIFN-γ收集液经排阻色谱除盐和冷冻干燥得到rhIFN-γ干粉.用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对rhIFN-γ干粉进行了测定,rhIFN-γ单体的相对分子质量为17184.0,二聚体的相对分子质量为34204.4.用细胞病变抑制法(CPEI)测定rhIFN-γ干粉的比活性为9.5×108IU/mg.用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定rhIFN-γ干粉的纯度高于95%.用色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ的质量回收率达到93.7%,纯度高于95%,比活性为4.3 x 107IU/mg.结果表明,采用PEG200-STHIC色谱柱复性并同时纯化rhIFN-γ是一种十分高效的方法.
关键词:
重组人干扰素-γ
,
蛋白折叠液相色谱法
,
高效疏水色谱
,
复性
,
纯化
李瑛
,
白泉
,
陈刚
,
王骊丽
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2008.03.013
建立了疏水型色谱饼(10 mm×20 mm i.d.)与反相色谱(RPLC)离线二维色谱快速分离制备人血清蛋白质组学样品,并用基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行检测的方法.以4种标准蛋白质的稀溶液为模型进行分离富集,得到细胞色素c(Cyt-c)与肌红蛋白(Myo)的检出限均为1 pmol/μL,溶菌酶(Lys)和胰岛素(Ins)的检出限为0.1 pmol/μL.将此方法用于人血清蛋白质组学样品的分离与制备,随着血清处理量的增大,质谱可检出的组分数目与信号强度均增加,当血清处理量达到 1.0 mL 时,可检出低丰度蛋白质或多肽285个(相对分子质量均在15 000以下).研究中将1 μg Cyt-c加入到0.5 mL血清中,用上述方法在分离富集低丰度Cyt-c上取得了很好的效果.结果表明,采用疏水型色谱饼与反相色谱联用技术不仅可对血清样品中低丰度蛋白质进行有效的分离和富集,而且一次样品的处理量大,可显著提高低丰度蛋白质的分析、检测水平.
关键词:
二维液相色谱
,
基体辅助激光解吸电离飞行时间质谱
,
色谱饼
,
蛋白质组学
,
人血清
毕晶
,
白泉
,
王军
,
王骊丽
色谱
采用疏水相互作用色谱(HIC)对还原变性核糖核酸酶A (RNase A)在疏水性液-固界面上的复性进行了研究.详细讨论了流动相中脲的浓度、还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)的比例、流动相pH和变性蛋白质浓度对还原变性RNase A复性效率和质量回收率的影响.结果表明,在最优化的复性条件(流动相中含有2.0 mol/L 脲,GSH/GSSG的浓度比为8∶1,流动相pH为8.0)下,还原变性RNase A能完全复性.当变性蛋白质质量浓度为5.0 mg/mL 时,还原脲变性RNase A的活性回收率和质量回收率分别为98.0%和61.9% ,还原胍变性RNase A分别为100.1%和66.8% .研究表明HIC是还原变性蛋白质复性的有力工具之一,可为蛋白质复性研究提供新方法和新思路.
关键词:
蛋白质复性
,
疏水作用色谱
,
还原变性
,
核糖核酸酶A
王建山
,
夏红军
,
万广平
,
刘家玮
,
白泉
色谱
doi:10.3724/SP.J.1123.2016.08019
以硅胶为基质、氨基己酸为配基制备了一种新型弱阳离子交换/疏水(WCX/HIC)双功能混合模式色谱固定相.该固定相配基具有一定的疏水性且含有羧基,在高盐浓度下表现为HIC的性质,可作为HIC固定相使用;在低盐浓度条件下表现为离子交换的性质,可作为WCX固定相使用.分别考察了该介质在WCX和HIC两种模式下对标准蛋白质的分离性能,并与商品柱进行比较.结果表明,所合成的WCX/HIC双功能固定相在WCX和HIC两种模式下对蛋白质均有较高的分离度和选择性,且分离能力与商品柱相当,两种模式下标准蛋白质的质量和活性回收率均大于93％,表明该柱具有“一柱二用”的功能,适于生物大分子的分离纯化.基于此双功能色谱柱构建的在线单柱二维液相色谱(2DLC-1C)可在60 min内实现8种蛋白质的快速分离.在70 min内完成了对蛋清中溶菌酶的二维纯化,纯度可达到98.3％.该技术中一根色谱柱可当作两根色谱柱使用,对蛋白质组学研究和重组蛋白药物的生产具有重要的应用价值.
关键词:
固定相
,
混合模式色谱
,
离子交换色谱
,
疏水色谱
,
二维液相色谱
柯从玉
,
白泉
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2004.04.026
研制出一种简易型色谱柱并通过装填大颗粒的疏水色谱填料对色谱柱的性能进行了考察,该柱的外形和操作如同传统的液相色谱柱,但它却在生物大分子分离方面有着和高效液相色谱相似的分辨率.另外,只要给该柱装填合适的固定相,比如疏水相互作用色谱固定相,便可用于蛋白质的复性及同时纯化.实验考察了该色谱柱的结构、操作和性能,包括柱压、柱寿命及对蛋白质的分辨率等.以溶菌酶为模型蛋白质,实验测得其在初始浓度为50.0 g/L时的质量回收率和活性回收率分别为(96.6±1.3)%和(101.1±6.0)%.这种简易型色谱柱价格低廉、易操作,且可在低压条件下对蛋白质进行纯化,表明其在对蛋白质药物的大规模纯化和复性方面有着很大的应用潜力.
关键词:
液相色谱
,
柱技术
,
溶菌酶
,
蛋白质
,
复性
,
纯化
陈刚
,
白泉
,
耿信笃
色谱
doi:10.3321/j.issn:1000-8713.2006.05.001
通过对硅胶基质进行化学改性键合伴刀豆球蛋白(Con A),制备了对糖蛋白具有特异亲和作用的亲和色谱固定相;该固定相非特异性吸附弱,对于糖蛋白和糖肽的分离效果良好.对亲和色谱的分离条件进行了优化,以标准糖蛋白核糖核酸酶B(RNase B)为模型,对其进行了纯化;用糖苷酶切除糖链,并对切除糖链前后的RNase B用胰蛋白酶酶解;用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对亲和色谱分离得到的糖蛋白、糖链及糖肽进行了分析,确定了RNase B的一级结构、糖含量、糖基化位点及糖连接方式.该方法快速准确,适于糖蛋白和糖肽的分离表征.将其应用于血清中糖蛋白及酶解后血清中糖肽的分离富集,取得了很好的效果.
关键词:
伴刀豆球蛋白
,
亲和色谱
,
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
,
糖蛋白
,
核糖核酸酶B
,
蛋白质组学
